? 生物醫藥行業的技術盛會
7月(yue)17-19日，由中(zhong)國藥(yao)學會主辦(ban)的“第七屆中(zhong)國藥(yao)學會生(sheng)物(wu)技術(shu)(shu)藥(yao)物(wu)質量(liang)分析(xi)研(yan)(yan)討會”盛大召開，來自(zi)生(sheng)物(wu)醫藥(yao)及(ji)(ji)科研(yan)(yan)領(ling)域的多位專(zhuan)家及(ji)(ji)現場近(jin)300位行(xing)業人士相聚夏(xia)日炎炎的北京，共同(tong)探(tan)討生(sheng)物(wu)醫藥(yao)行(xing)業內的研(yan)(yan)究(jiu)進展及(ji)(ji)前(qian)沿技術(shu)(shu)。
賽默飛(fei)色譜(pu)質譜(pu)生物制藥業務發展經理唐愷帶來《基于高(gao)分辨質譜(pu)平臺的宿主細胞殘(can)留(liu)蛋白(bai)（HCPs）檢(jian)測》的解決方(fang)案，助力(li)生物醫藥行業解決HCPs分析難題。
賽默飛色譜(pu)質譜(pu)生物制藥業務(wu)發展經理唐愷(kai)
什么是HCPs？為什么需要關注HCPs？
重組蛋白類藥物是由遺傳修飾的原核或真核宿主細胞培養/發酵產生，由于細胞凋亡/死亡/裂解，其他非必需蛋白質也可能釋放到細胞培養基/發酵液中，因此殘留在終產品中的其他蛋白質即為宿主細胞殘留蛋白（HCPs）。
HCPs的存在會影響藥物的安全性和有效性，以及具有蛋白水解活性的HCPs影響藥物產品的穩定性，因此生物醫藥公司不斷優化其純化工藝，從而控制終產品中HCPs的種類和含量。
現有分析方法有哪些不足？
目(mu)前ELISA方法因其高(gao)靈敏度、高(gao)通量和易操作優(you)勢成為(wei)工業界的(de)金標準，但仍存在很多限(xian)制。包括(kuo)：
1.不能對HCPs進行(xing)鑒定，低豐(feng)度HCPs的檢測易受限于高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)的干擾；
2.定(ding)量動態范圍（3個數量級）較低，抗體受(shou)限，開發周期長；
3.無(wu)法(fa)(fa)改(gai)變已(yi)有(you)的方法(fa)(fa)，缺少校正標準限制定量(liang)的準確性，因此需多(duo)種檢(jian)測方法(fa)(fa)相(xiang)結合。
高分辨質譜技術的優勢
隨著高分辨質(zhi)(zhi)譜(pu)技(ji)術性能的不斷提(ti)升，已具有高靈敏度和寬(kuan)的定量動態范圍，以及(ji)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組學技(ji)術的飛速發展，可實現對(dui)未(wei)知蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)的高通量定性和定量。
Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus
組(zu)合型四極桿Orbitrap質譜儀
基于nanoLC-MS/MS高靈敏平臺的方法，如何對HCPs進行準確定性和相對定量呢？
一、樣品前處理
2017年禮來制藥公司Huang, Lihua, et al.在Analytical Chemistry雜志上發表中的方法是，以NIST抗體標(biao)準(zhun)品為例(li)，在蛋白質(zhi)非變性(xing)的條件(jian)下進行酶(mei)切(qie)(qie)，抗體主成分被部(bu)分酶(mei)切(qie)(qie)，酶(mei)切(qie)(qie)后經90度高溫變性(xing)，未被酶(mei)切(qie)(qie)的部(bu)分將(jiang)被沉淀去除，從而提(ti)高HCPs的鑒(jian)定幾(ji)率和方法的動態范圍。
我們在此(ci)基(ji)礎上進(jin)一(yi)步優化，縮(suo)短前處理時間提高工作效率，同時為考察此(ci)套(tao)流程對1-100ppm的(de)HCPs的(de)鑒定和(he)相對定量能力，加入內標蛋(dan)白(bai)UPS2（48種(zhong)蛋(dan)白(bai)，6個不同濃度(du)）進(jin)行定性和(he)相對定量。
圖1.樣品前處(chu)理流程示(shi)意圖（來自Huang, Lihua, et al.）
二、儀器、色譜柱、數據分析軟件
目(mu)前根據(ju)液(ye)相色譜(pu)的(de)(de)流速(su)可分為納升(sheng)液(ye)相色譜(pu)（nanoLC,<1µL/min）、毛(mao)細管液(ye)相色譜(pu)（capillaryLC,1-1µL/min）、微流速(su)液(ye)相色譜(pu)（microLC,10-100µL/min）、分析流速(su)液(ye)相色譜(pu)（LC,>100µL/min），由于(yu)樣品單位(wei)濃度和(he)離子化效率依次下降(jiang)，因此其靈(ling)敏度逐漸(jian)下降(jiang)，本次實(shi)驗采用靈(ling)敏度zui高的(de)(de)納升(sheng)液(ye)相系統。
三、實驗結果
1.定性結果：
內(nei)標(biao)(biao)蛋(dan)白(bai)UPS2中(zhong)含有48種(zhong)內(nei)標(biao)(biao)蛋(dan)白(bai)6個不同(tong)濃度，共鑒(jian)(jian)定(ding)其(qi)(qi)中(zhong)24種(zhong)，其(qi)(qi)實際含量(liang)結果如(ru)表1，含量(liang)范(fan)圍(wei)為0.05-444.88ppm，實際含量(liang)>1ng（10ppm）的(de)16種(zhong)內(nei)標(biao)(biao)蛋(dan)白(bai)全部鑒(jian)(jian)定(ding)到(dao)，實際含量(liang)在(zai)0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范(fan)圍(wei)內(nei)共鑒(jian)(jian)定(ding)到(dao)6種(zhong)，此方(fang)案(an)的(de)靈敏度足以滿足生(sheng)物藥(yao)領域客戶的(de)需求。
表(biao)1.本次實驗(yan)中鑒定到UPS2內標蛋白的種(zhong)類及其實際含量
2.蛋白相對定量結果：
本次實(shi)驗(yan)進行HCPs的(de)(de)相對定(ding)量(liang)(liang)，采用蛋(dan)(dan)白(bai)TOP3的(de)(de)特異(yi)性肽段(duan)峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)的(de)(de)平均(jun)值(zhi)算(suan)法(fa)，得出(chu)每(mei)種蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)，經過三次技(ji)術重復，對特異(yi)性肽段(duan)大于(yu)(yu)等于(yu)(yu)1的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)進行統(tong)計，平均(jun)峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)分(fen)布如圖3A，峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)大于(yu)(yu)1e?的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)為此樣品(pin)的(de)(de)主抗體，可看出(chu)本實(shi)驗(yan)定(ding)量(liang)(liang)范(fan)圍達(da)6個數(shu)量(liang)(liang)級。UPS2內標蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)與含量(liang)(liang)的(de)(de)分(fen)布如圖3B，峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)與含量(liang)(liang)存(cun)在一定(ding)的(de)(de)線性關系， HCPs的(de)(de)相對含量(liang)(liang)可根據其峰(feng)(feng)面(mian)(mian)積(ji)進行初步(bu)判(pan)斷，進而(er)優化純化工(gong)藝。
圖(tu)3A.特(te)異性肽段大于等于1的(de)蛋白峰面(mian)積分布(bu)圖(tu)
圖(tu)3B.內標(biao)蛋(dan)白UPS2的峰面積（log2）與其含量的分布(bu)
基于UHPLC-MS/MS平臺的方法：
UHPLC-MS/MS對于低含量HCPs的檢測時，需提(ti)高上樣量（至少是納升液相系(xi)統的50倍(bei)）以(yi)提(ti)高其靈敏度。
經實例驗證此(ci)方法同樣滿足當前(qian)大部分需(xu)求，某抗體藥(yao)物的HCPs經ELISA定(ding)量為5ppm，UHPLC-MS/MS能夠準確(que)鑒定(ding)到6種HCPs（unique peptides≥2）,通(tong)過內標(biao)UPS2確(que)定(ding)其檢測限達1ppm，6種HCPs的相對含量在1-10ppm內。
小結
隨著(zhu)蛋(dan)白質組學(xue)的飛速發展，賽默飛Orbitrap高分辨質譜(pu)，可(ke)采用(yong)納升液相，超液相兩種方式，定(ding)(ding)性和相對定(ding)(ding)量分析HCPs，LOD均低(di)至1ppm以下，為(wei)傳統的ELISA方法補充更為(wei)豐富的信息，進一步幫助生(sheng)物醫藥企業優化(hua)純化(hua)工藝，監控終(zhong)產(chan)品和過程產(chan)物中的HCPs含(han)量。
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